خانه > اخبار > اخبار صنعت

راه های افزایش بیان پروتئین محلول چیست؟

زمان بروزرسانی: 2021-01-05

منبع:

بازدید: 70

راه های افزایش بیان پروتئین محلول چیست؟
به دلیل شرایط ساده کشت باکتریهای پروکاریوتی و معرفی راحت ژنهای خارجی ، به یک سیستم بیان پروتئین نوترکیب مهم تبدیل شده است. پس از تبدیل ژن به سویه ، القای آن برای بیان پروتئین هدف در سویه میزبان ، جمع آوری و خالص سازی آن یک روش معمول بیان پروتئین است.

با این حال ، پروتئین های پروکاریوتیک بیان شده که می توانند فعالیت بیولوژیکی از خود نشان دهند ، معمولاً پروتئین های محلول موجود در رویه هستند و اجسام انحلال نامحلول هیچ فعالیت بیولوژیکی ندارند.

بنابراین ، بیان محلول پروتئین هدف به پیگیری بیشتر آزمایش های بیان پروتئین تبدیل شده است. نحوه کاهش یا جلوگیری از ظهور اجسام شامل نیز مشکلی است که بیشتر مردم را آزار می دهد.

expression of soluble protein

بنابراین ، راه های افزایش بیان پروتئین محلول چیست؟


  • سرعت سنتز پروتئین را کاهش دهید

سنتز پروتئین در سریعترین زمان ممکن نیست. در بسیاری از موارد ، پروتئین ها در باکتری های پروکاریوتی بیش از حد سریع سنتز می شوند ، که منجر به زمان کافی برای جمع شدن و تشکیل اجسام انسداد نمی شود. با توجه به این ، می توانیم از جنبه های زیر شروع کنیم.


1. دمای کشت را کاهش دهید.

2. از مروج های ضعیف تر استفاده کنید.

3. غلظت القا کننده را کاهش دهید.

4- از پلاسمیدهای کم کپی به عنوان وکتور ژن های خارجی استفاده کنید.
به منظور افزایش بیان پروتئین ، بسیاری از افراد به طور عادی شرایط مختلف را در طی بیان پروتئین تنظیم می کنند ، مانند حفظ دمای مناسب کشت ، استفاده از پروموترهای قوی ، افزایش غلظت القاکننده ها و استفاده از پلاسمیدهای با کپی بالا.

این روش ها در واقع می توانند بیان پروتئین مورد نظر را افزایش دهند ، اما همچنین سرعت بیان پروتئین را بیش از حد سریع می کند ، و قادر به جمع شدن کامل و تشکیل اجسام انسداد نیست. بنابراین ، اگر بسیاری از نهادهای ورود به سیستم وجود داشته باشد ، تنظیم مناسب این عوامل تأثیرگذار ممکن است یک راه حل باشد.

هنگامی که این آزمایش به نتیجه نرسد ، از ابتدا زمان و انرژی زیادی برای کشف شرایط لازم است. توصیه می شود در ابتدای آزمایش با استفاده از پلاسمیدهای مختلف ، تقویت کننده های مختلف قدرت ، شرایط مختلف کشت و غلظت های مختلف القا کننده ، شرایط مختلفی را امتحان کنید. برای بهبود میزان تحمل خطا در آزمایش ، بهترین شرایط را برای بیان محلول در پروتئین کاوش کنید.

  • ترکیب متوسط را تغییر دهید

محیط کشت منبع مستقیم مواد مورد نیاز در رشد باکتری ها است. تنظیم ترکیب محیط کشت می تواند به تنظیم سرعت سنتز پروتئین باکتریایی و بهبود پایداری ساختار پروتئین کمک کند. اقدامات عبارتند از:


1. برای تنظیم pH در طی کشت ، بافر pH را اضافه کنید.

2. گروههای مصنوعی یا فاکتورهای کوآنزیمی را که به جمع شدن صحیح پروتئین ها و بهبود پایداری پروتئین کمک می کنند ، اضافه کنید.

3-محلول گلوکز 1٪ اضافه کنید تا بیان ناشی از IPTG (ایزوپروپیل تیوگالاکتوزید) کاهش یابد.

4- ساکارز و پلیول (یا سوربیتول) را اضافه کنید تا فشار اسمزی محلول محیط افزایش یابد. افزایش فشار اسمزی باعث تجمع عوامل محافظتی درون سلولی می شود ، که می تواند ثبات پروتئین هدف را بهبود بخشد.

5- اتانول ، مرکاپتانهای با وزن مولکولی کم ، ترکیبات دی سولفید و کلرید سدیم را اضافه کنید.

  • بیان مشترک با چاپرون مولکولی یا آنزیم تاشو


دو پروتئین ، چاپونهای مولکولی و آنزیمهای تاشو ، نقش بسیار مهمی در روند بیان پروتئین در موجودات زنده دارند. بیان همزمان آنها با پروتئین هدف می تواند باعث جمع شدن صحیح پروتئین و افزایش بیان پروتئین محلول در هنگام بیان پروتئین شود.

چاپرون های مولکولی: چپرون های مولکولی می توانند به تاخیر صحیح پیش سازهای پروتئین کمک کنند. چاپرونهای مولکولی معمولاً مورد استفاده در سیستم بیان E. coli شامل موارد زیر است:

GroES-GroEL ، DnaK-DnaJ-GrpE ، ClpB.

آنزیم تاشو: با کاهش سد انرژی در هنگام تا خوردن ، به پروتئین هدف کمک می کند تا یک ترکیب فعال ایجاد کند. سه نوع آنزیم تاشو زیر نقش مهمی در بیان پروتئین دارند.

1. PPI (پپتیدیل پرولیل سیس / ایزومراز ترانس) ؛

2. DsbA (دی سولفید اکسیدورودکتاز دی سولفید پیوند اکسیدورداکتاز) و DsbC (دی سولفید ایزومراز دی سولفید پیوند ایزومراز) ؛

3. PDI (پروتئین دی سولفید ایزومراز).

سطح بیان مشترک پروتئین هدف و چاپرون مولکولی یا آنزیم تاشو به ماهیت پروتئین خاص بستگی دارد. مطالعات نشان داده است که وقتی DsbA و DsbC با پروتئین ذوب می شوند ، می توانند سطح بیان محلول پروتئین را نیز افزایش دهند.

  • بیان مشترک با برچسب همجوشی


افزودن برچسب ها به N-terminal و C-terminal برای بهبود بیان محلول یک عمل معمول در اکثر آزمایشات است. برچسب هایی که معمولاً استفاده می شوند عبارتند از: MBP (پروتئین اتصال دهنده مالتوز) ، GST (گلوتاتیون سولف هیدریل ترانسفراز) ، SUMO (پروتئین اصلاح شده کوچک مانند یوبی کویتین) ، NusA ، TrxA (تیوردوکسین) و DsbA و DsbC که در بالا ذکر شد.

برچسب GST (گلوتاتیون سولف هیدریل ترنسفراز) متداول ترین برچسب محلول سازی است. این اثر خاصیت حل شدن خاصی دارد ، اما عمدتا برای تصفیه میل استفاده می شود. برچسب GST همچنین اثر مفید دیگری بر روی پروتئین های نوترکیب دارد که کاهش تخریب در سلول های میزبان و افزایش پایداری پروتئین است.

برجسته ترین ویژگی برچسب MBP توانایی تقویت انحلال در آن است. مطالعات نشان داده است که مزیت برچسب MBP این است که نقش مهمی در تقویت بیان محلول پروتئین های غشایی دارد. برچسب MBP به 42 پروتئین غشایی اضافه شد که در E. coli کمتر بیان شده یا بیان نشده بودند ، 29 مورد از آنها محلول بودند ، به ویژه همه پروتئین های کوچک مولکولی 10-20kD با موفقیت بیان شدند.

بزرگترین ویژگی برچسب های SUMO این است که می توان آنها را به طور خاص توسط پروتئاز SUMO شناسایی و به طور کارآمد تخریب کرد ، و فرآیند حذف برچسب بعدی را دقیق و کارآمد می کند. برچسب SUMO با موفقیت برای بیان همجوشی در باکتری ها استفاده شده است. این ماده نه تنها می تواند حلالیت پروتئین نوترکیب را افزایش دهد ، بلکه بیان آن را نیز افزایش دهد.

NusA دارای فعالیت بیولوژیکی در ترویج رونویسی DNA و کاهش سرعت ترجمه است که به پروتئین بیان شده زمان بیشتری برای جمع شدن می دهد. بیان پایدار و فعال پروتئین های نوترکیب را امکان پذیر می کند. حتی اگر برچسب NusA برداشته نشود ، پروتئین همجوشی همچنان می تواند فعال باشد. بنابراین ، اگر NusA با سایر برچسب های حل کننده مقایسه شود ، مزایای منحصر به فردی نیز دارد.

اگر در آزمایش با تعداد زیادی بدن شامل شوید ، ماده رویی مسئله را بیان نمی کند ،

همچنین می توانید روش های بالا را امتحان کنید. اگر هنوز نمی توانید آن را حل کنید ، می توانید Generalbiosystems را نیز در نظر بگیرید تا به شما کمک کند. ما یک شرکت آماده سازی پروتئین نوترکیب حرفه ای هستیم.