سه سیستم بیان پروتئین نوترکیب

انتخاب بردار بیان:

انتخاب بردار بیان پروتئین همجوشی توسط بسیاری از عوامل محدود شده است. اول از همه ، باید یک سایت شبیه سازی چندگانه مناسب در بردار وجود داشته باشد. در مرحله دوم ، لازم است با توجه به شرایط تصفیه پروتئین بعدی ، برچسب همجوشی مناسب انتخاب شود.

برچسب های همجوشی که معمولاً استفاده می شوند His.Tag ، GST.Tag ، Nus.Tag و Trx.Tag هستند. در میان آنها ، برچسب His نسبتاً کوچک است و هیچ تاثیری آشکار بر خصوصیات ساختاری پروتئین ندارد.

پس از تصفیه کروماتوگرافی میل ترکیبی ، حذف برچسب مورد نیاز نیست. با این حال ، یک برچسب کمی بزرگتر مانند GST باید در فرآیند بعدی با یک آنزیم خاص حذف شود. در بسیاری از کاربردهای عملی ، اغلب بیان پروتئین فعال محلول مطلوب است.

حلالیت یک پروتئین هدف خاص به عوامل زیادی از جمله ناقل بستگی دارد. حامل با GST.Tag می تواند حلالیت پروتئین همجوشی را افزایش دهد.

انتخاب سویه میزبان:

وضعیت بیان پروتئین یکسان در میزبانهای مختلف ممکن است متفاوت باشد. در حال حاضر میزبان های سری BL21 بیشترین استفاده را دارند. سویه میزبان رزتا که از BL21 گرفته شده است می تواند بیان پروتئین های یوکاریوتی را با کدون های نادر از E. coli افزایش دهد.

این سویه از طریق یک پلاسمید سازگار با کلرامفنیکل سازگار ، tRNA های کدون های AUA ، AGG ، AGA ، CUA ، CCC و GGA را تکمیل می کند. به این ترتیب ، سویه روزتا ترجمه ای "جهانی" را ارائه می دهد ، بنابراین از محدودیت بیان به دلیل فراوانی استفاده از کدون E. coli جلوگیری می کند. میزبان BL21 (DE3) تشکیل اجسام شامل را تسهیل می کند.

شرایط القایی:

تغییر در شرایط القایی نیز بر بیان پروتئین تأثیر می گذارد. به طور کلی ، پروتئین های محلول بیشتر در کاربردهای عملی مورد نیاز هستند ، که نیاز به یافتن مناسب ترین دمای القا دارد.

نسبت پروتئین محلول سنتز شده توسط اکثر پروتئین ها در دمای پایین (25 15 15 ℃) در شرایط القایی شبانه نسبتاً زیاد خواهد بود.

علاوه بر این ، غلظت القا کننده نیز در بیان پروتئین تأثیر دارد و غلظت کم القا کننده برای بیان پروتئین محلول مفید است. دمای بالاتر ممکن است سرعت سنتز پروتئین ، سرعت واسطه های تاشو برای تشکیل دانه ها و نیروی فعل و انفعال آبگریز را افزایش دهد.

پروتئین بیان شده احتمالاً به صورت اجسام شامل وجود دارد. غلظت بالاتر القا کننده (0.8-10 میلی متر IPTG) همچنین می تواند باعث تشکیل اجسام انسداد در باکتری شود. برای نوترکیب های PET با پروموترهای T7 معمولی ، IPTG با غلظت نهایی 0.5 میلی متر می تواند کاملاً القا شود ، در حالی که بردارهای دارای پروموتر T7lac برای القا completely کامل به IPTG با غلظت نهایی 0.8 میلی متر نیاز دارند.