خانه > اخبار > اخبار صنعت

راهکارهایی برای بیان پروتئین E. coli با بازده بالا

زمان بروزرسانی: 2020-11-12

منبع:

بازدید: 50

راهکارهایی برای بیان پروتئین E. coli با بازده بالا
سیستم بیان E. coli اولین و بالغ ترین سیستم بیان است. به دلیل زمینه ژنتیکی واضح ، تولید مثل سریع ، هزینه کم ، سطح بیان بالا ، تصفیه آسان محصولات بیان ، ثبات خوب ، توانایی ضد آلودگی قوی و دامنه کاربرد گسترده ، ابزاری قدرتمند برای تحقیقات اساسی و تولید تجاری پروتئین های نوترکیب است ؛ اما با این حال ، سیستم بیان پروکاریوتی هنوز هم کمبودهای زیادی دارد که برطرف کردن آنها دشوار است: مانند پروتئین نوترکیب ناپایدار ، فعالیت بیولوژیکی کم و بیان به شکل اجسام شامل. بازده بیان ژن های خارجی در E. coli تحت تأثیر عوامل زیادی قرار دارد. فقط با تجزیه و تحلیل و بهینه سازی پروتئین هدف قبل از بیان ، می توان به بیان کارآمد پروتئین هدف دست یافت ، که عمدتا شامل جنبه های زیر است:

(1) انتخاب بردار بیان.

انتخاب پروموتر بردار بیان بسیار مهم است. ساختار پروموتر بر میل آن با RNA پلیمراز تأثیر می گذارد ، در نتیجه بر میزان بیان ژن تأثیر می گذارد. مروج ایده آل باید موارد زیر را برآورده کند:

این خاصیت پرایمینگ قوی دارد و می تواند رونویسی کارآمد را برای اطمینان از عملکرد بالای پروتئین هدف هدایت کند.
این می تواند به شدت تنظیم شود ، و بیان می تواند تحت شرایط خاص ایجاد شود ، که می تواند بار متابولیکی باکتری ها و اثرات سمی پروتئین های خارجی را به حداقل برساند. موارد دیگر مانند موقعیت توالی SD و خاتمه دهنده رونویسی نیز بر رونویسی و کارایی ترجمه تأثیر خواهند گذاشت.

(2) بهینه سازی کدون.

وقتی ژنهای حاوی تعداد زیادی کدون نادر در E. coli بیان شوند ، کمبود tRNA های مشخص در E. coli باعث کاهش کارایی و پایداری ترجمه mRNA می شود و حتی باعث خطاهای ترجمه یا خاتمه زودرس می شود. اصلاح کدون ژن هدف می تواند پایداری و کارایی ترجمه mRNA را بهبود بخشد.


(3) پروتئین های همجوشی و چاپونهای مولکولی.

پروتئین های همجوشی نه تنها می توانند به عنوان برچسب های میل برای تسهیل عملیات تصفیه پایین دست استفاده شوند ، بلکه همچنین پروتئین های همجوشی ماکرومولکولی می توانند بیان محلول پروتئین ها را افزایش دهند ، مانند ترانسفراز گلوتاتیون-S (GST) ، پروتئین SUMO ، پروتئین اتصال دهنده مالتوز (MBP) بسیار آب دوست است ، به بهبود حلالیت و پایداری پروتئین هدف کمک می کند. بیان همزمان چاپرون های مولکولی می تواند باعث جمع شدن و پردازش پروتئین های نوترکیب پس از ترجمه شود و حلالیت و پایداری پروتئین را بهبود بخشد.

معمولاً در سیستم E.coli از سیستم های GroEL و GroES استفاده می شود. پروتئین شوک حرارتی سیستم سه تایی DnaK ، DnaJ و GrpE ؛ خانواده Dsb (ردوکتاز پیوند دی سولفید و ایزومراز) ، که می تواند باعث ایجاد پیوندهای دی سولفید شود.


(4) محلی سازی و بیان پروتئین هدف.

پس از سنتز پروتئین نوترکیب در E. coli ، 4 مکان یابی وجود دارد ، یعنی در سیتوپلاسم ، فضای periplasmic ، غشای داخلی یا خارجی و ماتریس خارج سلول.

از پپتیدهای سیگنال برای ترشح پروتئین های نوترکیب در محیط پلاسما یا خارج سلول استفاده کنید. محیط اکسیداتیو در فضای پلاسمایی منجر به تشکیل پیوندهای دی سولفید و چین خوردگی صحیح پروتئین های پایه تیو می شود. پروتئاز در فضای پریپلاسمی نسبت به سلولهای بسیار کمتر است تا تخریب پروتئین مورد نظر را کاهش دهد. تعداد پروتئین های موجود در فضای پلاسمایی نیز بسیار کمتر از سلول است که منجر به تصفیه پروتئین مورد نظر می شود.


(5) انتخاب سویه های بیان.

پروتئازهای درون زای بیش از حد در سویه ممکن است باعث عدم ثبات محصولات بیان برون زا شود. بنابراین ، برخی از سویه های کمبود پروتئاز اغلب به سویه های بیان اولیه ایده آل تبدیل می شوند.

سری Rosetta2 مکمل tRNA های (AUA ، AGG ، AGA ، CUA ، CCC ، GGA و CGG) مربوط به هفت کدون نادر فاقد E. coli است و سطح بیان ژن های خارجی ، به ویژه ژن های یوکاریوتی را در سیستم پروکاریوتی بهبود می بخشد. سویه های مشتق شده K -12 از سری Origami 2 ، trxB و gor جهش یافته های دوگانه ، به طور قابل توجهی احتمال تشکیل پیوند دی سولفید را در سیتوپلاسم افزایش می دهند و بیان پروتئین محلول را افزایش می دهند. Rosetta-gami the ترکیبی از مزایای دو نوع فشار فوق است.

این ماده نه تنها 7 نوع کدون نادر را مکمل می کند ، بلکه باعث ایجاد پیوندهای دی سولفید می شود و به بیان پروتئین های یوکاریوتی که به کمک پیوندهای دی سولفید برای ایجاد یک ترکیب تا شده صحیح نیاز دارند ، کمک می کند.


(6) شرایط القا و شرایط فرهنگ

شرایط القا و شرایط کشت نیز برای بیان پروتئین های نوترکیب مانند دما بسیار مهم است. وقتی درجه حرارت بالاتر است ، میزان بیان پروتئین زیاد است اما تشکیل بدن شامل آسان است ، در حالی که وقتی دما کم است ، بیان پروتئین پایین است ، اما می تواند حلالیت پروتئین مورد نظر را افزایش دهد. غلظت القا کننده همچنین بر کارایی بیان پروتئین نوترکیب تأثیر می گذارد ، از جمله القای IPTG با غلظت کم می تواند محتوای پروتئین محلول را افزایش دهد.

علاوه بر این ، ترکیب مواد مغذی ، pH و سایر پارامترهای محیط می تواند بر فعالیت ، ترشح و میزان بیان پروتئاز تأثیر بگذارد.



برای بیان پروتئین های خارجی در E. coli ، تجزیه و تحلیل قبل از بیان بسیار مهم است. تجزیه و تحلیل خاص ژن و پروتئین هدف ، بررسی جامع و انتخاب مناسب ترین سیستم و روش بیان می تواند به بیان کارآیی پروتئین های خارجی دست یابد.