خانه > اخبار > اخبار شرکت

اشکال مختلف بیان پروتئین در E. coli

زمان بروزرسانی: 2020-10-19

منبع:

بازدید: 54

اشکال مختلف بیان پروتئین در E. coli

مطالعه ساختار و عملکرد ژن خارجی در سیستم بیان پروتئین در شرایط آزمایشگاهی ، بخش مهمی از تحقیقات زیست شناسی مولکولی است. بیان پروتئین در شرایط in vitro شامل بیان همجوشی و بیان غیر همجوشی و همچنین بیان در سیستم های بیان پستانداران ، سیستم های بیان مخمر و سیستم های بیان سلول حشرات است. اشرشیاکلی دارای ویژگی های درک کامل از صفات وراثتی ، رشد سریع ، فرهنگ اقتصادی و سطح بیان بالا است.

بنابراین ، بیان E. coli برای مدت طولانی سیستم بیان ترجیحی برای بیان پروتئین های خارجی بوده است.



سیستم بیان اشریشیا کلی باکتریهای مهندسی ارجح برای بیان پروتئین است ، و همچنین پرکاربردترین سیستم بیان پروکاریوتیک کلاسیک است.

محققان General Biosystems یک پلت فرم خدمات بیان و تصفیه پروتئین E. coli بالغ ایجاد کرده اند که خدمات بیان و تصفیه از جمله پروتئین های نوترکیب مختلف و مجتمع های آنها را در E. coli ارائه می دهد.

اشرشیاکلی توسط غشای خارجی و داخلی به سه حفره تقسیم می شود. پروتئین هدف بیان شده توسط E. coli در سه حفره داخل سلولی ، خارج سلولی و پری پلاسم قرار دارد.
با توجه به محل قرارگیری محصول بیان ، بیان ژن هدف در E. coli به طور کلی به بیان داخل سلولی و بیان ترشحی تقسیم می شود.
در میان آنها ، بیان داخل سلولی مهمترین شکل بیان است و محصولات بیان آن را می توان به فرم های محلول و بدن حلال نامحلول تقسیم کرد. با توجه به ماهیت پروتئین هدف ، فرم بیان پروتئین هدف در E. coli به بیان همجوشی و بیان غیر همجوشی تقسیم می شود.

1. بیان داخل سلولی


پروتئین هدف بیان شده توسط E. coli اغلب در سلول قرار دارد. به منظور جلوگیری از تجمع بیش از حد محصول بیان در سلول و تأثیر بر رشد سلول و یا تشکیل اجسام انسداد ، پروتئین هدف محلول می تواند از توالی عملکردی خود و سیستم پردازش و انتقال پروتئین E. coli استفاده کند ، در نهایت غشای سلول را عبور داده و در فضای پلاسمایی بین غشای سلول و دیواره سلول یا مایع کشت سلول ترشح می شود.

2. بیان مخفی


پروتئین نوترکیب هدف از غشای داخلی E. coli عبور می کند تا به فضای اطراف پلاسمایی برسد ، یا از غشای خارجی عبور می کند تا به فضای خارج سلول برسد ، که به آن ترشح می گویند. یک سری ساختارهای توالی پروتئین Sec مربوط به ترشح پروتئین های E. coli به فضای پلاسمایی و انتقال غشای خارج از سلول پیدا شده است ، از جمله SecA ، SecB ، SecD ، SecE ، SecF ، SecG و SecY [9 ، این 7] . علاوه بر پروتئین Sec ، چاپرونهای مولکولی مانند GroES / GroEL ، DnaK / DnaJ و h / Ffs نیز در انتقال نقش دارند.

3. بیان محلول


بیان ژن هدف در اشرشیاکلی معمولاً قادر به بدست آوردن بیان محلول با فعالیت بیولوژیکی است. با این حال ، پروتئین های خارجی اغلب به راحتی توسط پروتئازهای میزبان تجزیه می شوند یا در حین دستیابی به سطوح بالایی از بیان ، بدن های انسداد تشکیل می دهند.

بنابراین ، لازم است بیان محلول پروتئین های خارجی در E. coli کشف شود. برای بهبود بیان محلول پروتئین نوترکیب ، ابتدا لازم است یک ناقل مناسب و باکتری میزبان انتخاب شود و ثانیاً ، می تواند سرعت سنتز پروتئین نوترکیب را نیز کاهش دهد.


مطالعات بر روی مدل های سینتیک پروتئین نشان می دهد که عملکرد پروتئین فعال به سرعت سنتز پروتئین ، میزان تا شدن پروتئین و میزان تجمع پروتئین بستگی دارد.

در سطوح بالایی از بیان ، هرگاه میزان تجمع زنجیره پپتیدهای نوپا از میزان تا شدن پروتئین بیشتر شود ، منجر به تشکیل اجسام انسداد می شود.

بنابراین ، کاهش سرعت سنتز پروتئین نوترکیب برای افزایش بیان محلول پروتئین نوترکیب مفید است.

روش های معمول استفاده شده شامل کاهش درجه حرارت کشت ، انتخاب پروموتر مناسب و استفاده از غلظت کمتری از القا کننده است.



ترکیب محیط تأثیر قابل توجهی در بهبود بیان محلول پروتئین های نوترکیب در E. coli دارد.

چاپرون مولکولی نوعی پروتئین است که می تواند به زنجیره پلی پپتیدی کمک کند تا ساختار سه بعدی درست ایجاد کند.

این امر عمدتا با جلوگیری و یا تصحیح اتصال آبگریز غیرمعقول به جمع شدن زنجیره پپتید کمک می کند. مطالعات نشان داده است كه بیان همزمان با چاپرونهای مولكولی می تواند حلالیت پروتئین مورد نظر را بهبود بخشد و اگر چندین چاپرون مولكولی به طور همزمان بیان شود ، می توان نتایج بهتری نسبت به استفاده از آنها به تنهایی بدست آورد.

شایان ذکر است که انتخاب چاپرونهای مولکولی هم بیان باید بر اساس مشخصات خود پروتئین نوترکیب باشد.

ساختار اولیه پروتئین ، یعنی توالی اسیدهای آمینه ، عامل مهمی است که در شکل گیری اجسام انسداد تأثیرگذار است. جایگزینی یک یا چند اسید آمینه در پروتئین می تواند از تشکیل اجسام انسداد جلوگیری کرده و حلالیت محصول بیان شده را افزایش دهد.

دلیل احتمالی این است که آبگریزی پروتئین نوترکیب تغییر می کند یا ثبات پروتئین نوترکیب پس از جهش افزایش می یابد.


4. فرم بیان شامل بدن


با این حال ، هنگامی که پروتئین هدف به مقدار زیاد بیان شود ، محصول بیان در E. coli جمع می شود و ذرات جامد غیرفعال تشکیل می شوند ، به نام اجسام انسداد.

پروتئین هدف از بدن انسداد دارای توالی اسید آمینه صحیح است ، اما از آنجا که به درستی جمع نشده و دارای خطای ترکیب فضایی است ، به طور کلی از نظر بیولوژیکی فعال نیست.

در مقایسه با محصولات پروتئین محلول محلول ، بدن های دارای انسولین دارای مزایای غنی سازی پروتئین هدف ، مقاومت در برابر پروتئازها و سمیت کمتر برای میزبان هستند.

دلیل اصلی تشکیل اجسام شامل ، کمبود برخی فاکتورها برای جمع شدن پروتئین در هنگام بیان پروتئین هدف نوترکیب است ، یا محیط مناسب برای تشکیل پیوندهای ثانویه صحیح نیست.

عوامل اصلی تأثیرگذار در تشکیل اجسام انسداد ، ماهیت خود پروتئین ، شرایط کشت و پروتئین های چاپرون مولکولی است.


5. بیان پروتئین همجوشی


بیان پروتئین همجوشی برای اتصال مناطق رمزگذاری دو یا چند ژن است که انتها به انتها می رسد و سپس توسط همان توالی نظارتی کنترل می شود ، به طوری که بیان همجوشی پروتئین هدف دارای بازده بالا ، تخریب کمتر و تصفیه ساده و راحت است.

علاوه بر این ، می توان از محل تجزیه مواد شیمیایی یا محل تجزیه پروتئاز ساخته شده در بردار بیان همجوشی برای حذف پپتید پروکاریوتی پروتئین همجوشی در شرایط آزمایشگاهی استفاده کرد تا یک محصول پروتئینی طبیعی بدست آورد.

از آنجا که تهیه پروتئین همجوشی آسان است ، برای حفظ فعالیت و ایمنی زایی پروتئین اصلی احتمال بالاتری دارد و همچنین می توان با تجارتی امکان تجزیه پروتئین همجوشی بعدی را برای بدست آوردن پروتئین یوکاریوتی داخل آن فراهم کرد.

علاوه بر این ، بیان همجوشی نه تنها می تواند میزان بیان پروتئین را افزایش دهد ، بلکه به پروتئین هدف نیز کمک می کند تا به درستی برابر شود تا پروتئین محلول بدست آید.


در حال حاضر ، سیستم های بیان همجوشی که بیشتر مورد استفاده قرار می گیرند شامل سیستم PA ، سیستم PG ، سیستم همجوشی His ، سیستم GST ، سیستم FLAG ، سیستم MBP ، سیستم همجوشی TrxA و غیره است.

محصول بیان شده در بیان پروکاریوتی بسیار کارآمد ، نسبتاً پایدار است و به راحتی توسط میزبان تخریب نمی شود.


6. بیان پروتئین غیر همجوشی


بیان غیر همجوشی یک پروتئین بیان شده که با هیچ پروتئین یا پلی پپتیدی از سلول میزبان ذوب نشده است ، قرار دادن ژن هدف در پروموتر قوی بردار بیان و پایین دست توالی SD است ، با کدون شروع AUG از ژن هدف به عنوان نقطه شروع ترجمه.

انتهای N زنجیره پپتید پروتئین هدف بیان شده حاوی پروتئین بیان شده توسط بردار بیان پروکاریوتی نیست و پروتئین هدف بیان شده با توالی ، ساختار و ایمونوژن با پروتئین طبیعی سازگار است.

پروتئین های غیر همجوشی به راحتی توسط پروتئازهای موجود در سلول های میزبان تخریب یا از بین می روند و پروتئین های غیرفعالی تولید می کنند که بر کارایی بیان تأثیر می گذارد.


بیان پروتئین های خارجی در اشرشیاکلی از مزایای سطح بیان بالا ، عملکرد آسان و هزینه کم برخوردار است.

فرم های بیان متداول شامل بیان داخل سلولی ، بیان ترشحی ، بیان محلول ، فرم بدن نامشخص نامحلول و بیان همجوشی و بیان غیر همجوشی است.

چندین فرم بیان پروتئین های خارجی در E. coli یک پروژه سیستماتیک است. بنابراین ، ما باید در روند تحقیق تجربیات را جمع کنیم تا به کلید بهبود کارایی بیان پروتئین نوترکیب پی ببریم.

بنابراین ، می توان از سیستم بیان E. coli برای بیان مقدار زیادی پروتئین خارجی فعال استفاده کرد.


General Biosystems ، یک شرکت خدمات بیان و تصفیه پروتئین ، می تواند خدمات میزبان رایج تری از جمله E. coli ، مخمر و سلول های پستانداران را به مشتریان ارائه دهد. اگر می خواهید از سلول های میزبان دیگر یا سیستم های بیان بدون سلول استفاده کنید ، لطفا با ما تماس بگیرید.