خانه > اخبار > اخبار صنعت

پروتئین و پروتئین تصفیه پروتئین

زمان بروزرسانی: 2020-10-15

منبع:

بازدید: 62

پروتئین و پروتئین تصفیه پروتئین

مطالعه عملکردهای پروتئین و تولید پروتئینهای عملکردی اساساً از بیان و تصفیه پروتئینهای ناهمگن جدا نیستند.

امروز من در مورد بیان پروتئین و تصفیه از جنبه های زیر با شما صحبت خواهم کرد.


1. انتخاب برچسب


برچسب های بیان رایج در حال حاضر شامل برچسب His (برچسب هیستیدین) ، برچسب GST (برچسب گلوتاتیون سولف هیدریل ترانسفراز) ، برچسب MBP (برچسب پروتئین اتصال دهنده مالتوز) ، برچسب CBD (برچسب منطقه اتصال کیتین)) صبر کنید.

هر برچسب از ویژگی های منحصر به فردی برخوردار است ، مانند وزن مولکولی برچسب ، توانایی آن در تنظیم حلالیت پروتئین ، تأثیر آن بر روی تاشو پروتئین ، آیا نیاز به برش دارد و غیره.

با توجه به خصوصیات پروتئینی که می خواهید تصفیه کنید ، یک برچسب مناسب انتخاب کنید. برچسب به خوبی انتخاب شده است و آزمایش های بعدی با نیمی از تلاش دو برابر نتیجه می گیرند.

2. ساخت بردار


پس از انتخاب برچسب مورد استفاده ، تهیه بردار بیان ضروری است. در حال حاضر ، بردارهای تجاری زیادی برای انتخاب وجود دارد ، مانند سری pET28 با برچسب His و سری pMAL با برچسب MBP.

بیشتر مجموعه های برداری شامل فرم قرار دادن برچسب در ترمینال N یا ترمینال C است که می تواند با توجه به ویژگی های پروتئین به صورت انعطاف پذیر انتخاب شود.

هنگام قرار دادن ژن رمزگذار پروتئین ، باید توجه داشته باشید تا از تغییر فریم جلوگیری شود. اگر می خواهید یک بردار را از ابتدا بسازید ، فراموش نکنید که یک پروموتر مناسب و توالی خاتمه رونویسی را وارد کنید. توالی های پروموتر معمولاً از پروموترهای القایی استفاده می کنند ، مروجین سازنده باعث بروز زودرس و تجمع پروتئین های خارجی می شوند ، که برای تکثیر میزبان مناسب نیست.


3. انتخاب میزبان


میزبانهای مشترک E. coli ، سلولهای پستانداران ، مخمر و حشرات هستند. برای E. coli ، مناسب ترین سویه برای بیان هترولوگ ، BL21 و سویه های مشتق شده آن است ، اما هنوز هم باید با توجه به عناصر رونویسی و ترجمه انتخاب شده در بردار ، انتخاب شود.


ژن پروتئاز درون زا در BL21 وجود ندارد ، بنابراین سویه ای مناسب برای بیان پروتئین خارجی است ، اما T7 RNA پلی مراز ندارد ، بنابراین نمی توان از آن برای بیان پروتئین حاوی پروموتر T7 استفاده کرد. BL21 (DE3) ، در BL21 بر اساس ادغام ژن فاژ T7 ، برای سیستم های بیان T7 ، مانند سری PET مناسب است. BL21 (DE3) PLyS ها ، مبتنی بر BL21 (DE3) ، با ژن لیزوزیم T7 ، که می تواند بیان T7 پلیمراز را با دقت بیشتری کنترل کند.


لازم به ذکر است که به دلیل وجود ژنهایی مانند اندونوکلئاز (endA1) recombinase (recA1) ، پلاسمید در سری BL21 از سویه ها چندان پایدار نیست و ممکن است در ژنوم ، از دست دادن ، جهش و غیره ادغام شود ، بنابراین یک بردار خوب بسازید هنوز هم باید در سویه هایی مانند DH5α ذخیره شود.


4. بهینه سازی شرایط فرهنگ


با استفاده از سیستم بیان E. coli به عنوان نمونه ، از محیط LB می توان هم برای احیا و هم برای کشت بذر استفاده کرد.

بهتر است در مرحله تخمیر از محیطی با محتوای اسید آمینه بالاتر اما منبع قند پایین تر مانند محیط سل استفاده شود تا سنتز و تجمع پروتئین را تقویت کند.

اگر از یک پروموتر القایی استفاده شود ، هنگام رشد باکتری ها به مرحله رشد لگاریتمی دیر ، باید القا کننده ای مانند IPTG اضافه شود.

پس از افزودن القا کننده ، دمای کشت باید به 16-30 درجه سانتیگراد کاهش یابد. هرچه دمای کشت کمتر باشد ، تجمع پروتئین کندتر می شود و احتمال تولید اجسام انسداد کمتر است.


5. انتخاب مواد ستون تصفیه

هر برچسب دارای یک ماده ستون تصفیه مربوطه است. در برچسب GST از ژل گلوتاتیون ، برچسب MBP از رزین پلی ساکارید ، برچسب CBD از رزین کیتین و در برچسب His از پرکننده های همراه با یون های فلزی دو ظرفیتی استفاده می شود که متداول ترین آنها همراه با یون نیکل است که به عنوان ستون نیکل شناخته می شود.

بسته بندی ستون نیکل NEBExpress (S1428S) به تازگی در نوامبر 2019 راه اندازی شده است. همچنین یک فرم ستون چرخشی از پیش بسته بندی شده (S1427S / L) وجود دارد که برای تصفیه پروتئین های کوچک در مرحله غربالگری مناسب تر است. خالص سازی 1 میلی گرم پروتئین دارای برچسب وی فقط 15 دقیقه طول می کشد.

هر بسته 1 میلی لیتری ستون نیکل می تواند 10 میلی گرم پروتئین دارای برچسب هیستیدین را خالص سازی کند.

اتصال بسیار ویژه به پروتئین های دارای برچسب His ، خلوص> 95٪ پس از جداسازی و خالص سازی.

اتصال قوی یون نیکل آن را در برابر EDTA و عوامل احیا کننده بسیار مقاوم می کند و با معرفهای لیز سلول متشکل از مواد شوینده سازگار است.