خانه > اخبار > اخبار صنعت

چگونه در آزمایش های بیان پروتئین با بدن های ورود کننده مقابله کنیم؟

زمان بروزرسانی: 2021-01-05

منبع:

بازدید: 62

چگونه در آزمایش های بیان پروتئین با بدن های ورود کننده مقابله کنیم؟
بیان پروتئین اغلب با چه مشکلاتی روبرو می شود؟ نهادهای ورود به سیستم یکی از آنهاست. برای بیشتر آزمایش ها ، اجسام شامل مانند دنده مرغ است. با این حال ، این اغلب مشکلی است که باید در روند بیان پروتئین پروکاریوتی برطرف شود.

بهترین راه البته اجتناب از ظهور اجسام انسداد است ، اما پروتئین های زیادی نیز وجود دارد که در هنگام بیان پروکاریوتی نمی توان آن را به شکل رویه بدست آورد. در این زمان ، تجدید بدن اجسام ورود به پروتئین های فعال به بهترین انتخاب تبدیل می شود.
处理 蛋白 表达 实验 中 出现 的 包涵体?

جداسازی و شستشوی اجسام شامل

اجسام شامل تعداد چگالی بیشتری نسبت به سایر اجزا دارند ، بنابراین می توان آنها را با سانتریفیوژ جمع کرد. پس از تیمار باکتریها با لیزوزیم ، سلولها معمولاً در اثر همگن سازی فشار بالا مختل می شوند.

از آنجا که لیپوزومها و غشای سلولی تا حدی شکسته و پروتئینهای غشایی ممکن است به اجسام انسداد بچسبند ، اجسام انسداد باید قبل از دناتوراسیون و انحلال شسته شوند ، معمولاً با غلظت کمی از دناتورانس مانند هیدروکلرید گوانیدین 5/1-1 میلی متر

علاوه بر این ، شما همچنین می توانید با مواد شوینده ملایم 1٪ TritonX-100 یا سدیم دیوکسی کولات بشویید تا قطعات غشا و پروتئین های غشا را از بین ببرید.

انحطاط بدن شامل

اجسام مربوط به قرار دادن را در بافر حاوی ماده دناتورانس و کاهنده (معمولاً 20 میلی مولار DTT یا β-مرکاپتواتانول) از بین ببرید و انکوباسیون کنید. افزودن عامل كاهش دهنده می تواند Cys را در حالت كاهش یافته نگه دارد. همچنین می تواند پیوندهای دی سولفید موجود در پروتئین ها را بشکند.

دمای انکوباسیون در طی فرآیند دناتوراسیون معمولاً در 30 درجه سانتیگراد حفظ می شود تا انحلال پروتئین را افزایش دهد. بهینه سازی شرایط مختلف در این فرآیند با توجه به ویژگی های پروتئین خاص تعیین می شود و می توان برای یافتن بهترین شرایط انحلال آزمایشی در مقیاس کوچک انجام داد.
处理 蛋白 表达 实验 中 出现 的 包涵体?
چگونه در آزمایش های بیان پروتئین با بدن های ورود کننده مقابله کنیم؟

موارد زیر شرایط آزمایشی برای دناتوراسیون به طور کلی است:

پس از اتمام دناتوراسیون اجسام شامل ، سانتریفیوژ برای از بین بردن مواد نامحلول باقیمانده مورد نیاز است ، در غیر این صورت مواد نامحلول باقیمانده ممکن است باعث تجمع پروتئین و رسوب در طی فرآیند جمع شدن پروتئین مورد نظر شوند. برای سانتریفیوژ بهتر است از سانتریفیوژ فوق العاده (100000 گرم ، 30 دقیقه) استفاده شود.

تا شدن مجدد پروتئین محلول

اولین مرحله از تجدید طبیعی ، حذف ماده دناتورات است. مهمترین فاکتورهای نامطلوب در روند تجدید تجدید پروتئین ، جمع شدن غلط و رسوب پروتئین است.

به منظور جلوگیری از رسوب پروتئین در طی فرآیند تجدید نیرو ، کاهش غلظت پروتئین ضروری است و دامنه غلظت پروتئین در طی 10-100mg / ml کنترل می شود.

برای پروتئین های مختلف ، شرایط تجدید حیات باید بهینه شود. عوامل مهم در فرآیند تجدید نیرو به شرح زیر است:
  • ترکیب بافر (pH ، غلظت) ؛
  • درجه حرارت؛
  • مواد افزودنی (معمولاً از چند ماده افزودنی با هم استفاده می شود).

عامل دناتوراسیون و عامل کاهنده از بین می روند و مولکول پروتئین دناتوره شده با یک محیط بازسازی و بازسازی صحیح تأمین می شود و می توان پروتئین فعال طبیعی را بدست آورد. متداول ترین روشهای تجدید شیر استفاده می شود دیالیز ، رقت ، کروماتوگرافی و غیره.

دیالیز متداول ترین روش در آزمایشگاه ها است ، اما زمان زیادی طول می کشد و به راحتی سنگدانه های غیرفعال غیرفعال را تشکیل می دهد. MaedaY با استفاده از محلول اوره 8mol / L به عنوان دیالیز اولیه ، یک روش دیالیز آهسته را طراحی کرد و سپس محلول بدون اوره را به تدریج افزایش داد تا غلظت دناتورانس کاهش یابد.

در این روش ، غلظت دناتورانس به طور مداوم و آهسته تری کاهش می یابد و هیچ جهشی در غلظت دناتورانس در روش رقت وجود ندارد ، که ممکن است به کاهش میزان بارندگی در طی تجدید رشد پروتئین های خاص و افزایش عملکرد پروتئین های فعال کمک کند. با استفاده از این روش ، میزان تجدید شیر IgG به میزان 70 میلی گرم در میلی گرم در میلی لیتر رسید.

رقت ساده ترین و مثرترین روش جمع کردن است. پس از رقت ، هنگامی که عامل دناتوره و کاهنده به غلظت خاصی کاهش می یابد ، مولکول های پروتئین شروع به جمع شدن مجدد می کنند ، اما مقدار مایع فرآوری شده زیاد است که برای تقویت صنعتی مناسب نیست. روش های رقت فعلی عمدتا شامل رقت یک بار ، رقت قطعه ای و رقت سریال است.

تجدید تقویم کروماتوگرافی یک روش تجدید اشباع است که بیشتر مورد مطالعه قرار گرفته است. از ستون های کروماتوگرافی برای حذف دناتورات استفاده می شود. روش های معمول کروماتوگرافی شامل الک های مولکولی ، کروماتوگرافی تبادل یونی و کروماتوگرافی میل ترکیبی است.

هنگامی که پروتئین به آرامی در ستون مهاجرت می کند ، می توان دناتورانس را خارج کرد ، یا پروتئین به ستون کروماتوگرافی متصل شده و از دناتورنت جدا می شود. تجدید کروماتوگرافی معمولاً برای تجدید رشد پروتئین در مقیاس بزرگ مورد استفاده قرار می گیرد و غلظت پروتئین تجدید اشغال تا میلی گرم در میلی لیتر است.


اگر در آزمایش با تعداد زیادی بدن شامل شوید ، ممکن است روشهای بالا را نیز امتحان کنید. اگر هنوز نمی توانید آن را حل کنید ، می توانید Generalbiosystems را نیز در نظر بگیرید تا به شما کمک کند. ما یک شرکت آماده سازی پروتئین نوترکیب حرفه ای هستیم.