خانه > اخبار > اخبار صنعت

چهار رویکرد subcloning

زمان بروزرسانی: 2020-08-06

منبع:

بازدید: 88

چهار رویکرد subcloning
از دیدگاه شرکتی که در خدمات زیر طبقه بندی تخصص دارد ، generalbiosystems پاسخی در مورد رویکردهای استفاده شده توسط subcloning به شما ارائه می دهد.

✦ هضم محدودیت

اندونوکلئازهای محدودکننده (RE) ، که بعلاوه به عنوان آنزیم های محدود کننده شناخته می شوند ، پروتئین هایی هستند که سری DNA های کوتاه و جزئی (به طور معمول پالیندرومیک) را شناسایی می کنند. Kind II REs DNA دو رشته ای (dsDNA) را در وب سایت های خاصی در توالی های شناسایی یا کنار آنها جدا می کند.

بسیاری از آنزیم های محدود کننده قطعاً DNA ای را که روی یک یا هر دو مو محل تأیید متیله می شود ، کاهش نمی دهند ، اگرچه برخی خواستار متیلاسیون بستر هستند.


هضم محدودیت جزئی

کنترل فرکانس برش در هضم محدود کننده

قابل مشاهده بودن یک وب سایت تشخیص محدودیت در درج و همچنین منطقه شبیه سازی متعدد ، لزوماً مانع استفاده از آن وب سایت محدودیت در یک روش ساب کلونینگ نمی شود. در شرایط جذب محدود ، آنزیم بیش از حد است تا اطمینان حاصل شود که تمام مکان های تصدیق در پلاسمید می توانند تجزیه شوند.

شما می توانید شرایط هضم محدودیت را طوری دستکاری کنید که مطمئناً فقط بخشی از وب سایت ها را هضم کنید.

در واقع روشهای زیادی برای هضم جزئی استفاده شده است: کاهش سطح دمای واکنش ، استفاده از سد غیربهینه و کاهش سیستمهای آنزیم.


بردارهای دفسفوریلاسیون برای محدود کردن خودبزرگ بینی

توقف خود-بستن ناقل برای کاهش سابقه ساب کلونینگ ضروری است. کارایی اتصال پلاسمید به خود بسیار بهتر از اتصال قطعه جداگانه ای از DNA درست در ناقل است و پاسخ ترجیحی است. خلاص شدن از شر 5 ′ فسفات بردار خطی باعث جلوگیری از چرخش مجدد بردار T4 DNA Ligase می شود. گوساله آلکالن فسفاتاز آنزیم بی انتها برای دفسفوریلاسیون ناقل است.

از آنزیم می توان در انتهای 5 ′ فرو رفته استفاده کرد (یعنی از آنزیمی خارج می شود که دارای یک برآمدگی 3 باشد) ، 5 ′ برآمدگی و همچنین کنده دارد.

پس از دفسفوریلاسیون ، آنزیم باید با خالص سازی مستقیم یا الکتروفورز ژل و همچنین جدا شدن ژل با سیستم های فیلتراسیون DNA مانند سیستم تمیز کردن ژل و PCR از بین برود.

میگو آلکالین فسفاتاز می تواند به جای استخوان گوساله آلکالن فسفاتاز دستگاه روده مورد استفاده قرار گیرد و همچنین مزیت دناتوراسیون گرمایی ساده برای تعلیق آنزیم را بدون نیاز به فیلتراسیون بیشتر فراهم می کند.


بردار تصفیه و همچنین درج

فیلتراسیون درج و همچنین بردار مکان برای موفقیت در کاربردهای زیر طبقه بندی کاملاً ضروری است.

سالها پیش ، هر مرحله به فنل نیاز داشت: استخراج کلروفرم که توسط باران اتانول انجام می شود تا آنزیم هایی مانند آلکالین فسفاتاز هضم گوساله را از کنترل بردارهای شیمیایی حذف کند.

سیستم های پاک کننده اسید نوکلئیک مبتنی بر گوانیدین به طور قابل توجهی حذف آنزیم ها را ساده می کند.

رویکردهای جداسازی ژل با جداسازی کاتالیزورهای تحت تعقیب از واکنش دهنده های نامطلوب ، حتی بیشتر باعث افزایش اثر subcloning می شوند.