خانه > اخبار > اخبار صنعت

عوامل موثر بر بیان پروتئین

زمان بروزرسانی: 2020-10-27

منبع:

بازدید: 50

عوامل موثر بر بیان پروتئین

هنگام انجام آزمایش های بیان پروتئین ، گاهی اوقات آزمایش احساس می کند که با روش آزمایش مرجع و توالی ژن پروتئین کلون شده مشکلی وجود ندارد و الکتروفورز پروتئین نتیجه ای ندارد.

دلایل عدم بیان پروتئین به طور خلاصه بیان شده است.


1. ساخت نادرست بردار. این غیر معمول نیست و بسیاری از کلونرهای جدید اغلب قاب خواندن را اشتباه می گیرند. به عنوان مثال ، بردارهای سری pQE Qiagen اغلب دارای اختلاف یک یا دو پایه در مکان های شبیه سازی خود هستند. علاوه بر این ، برخی از آنزیم ها انتهای چسبنده و برخی آنزیم ها انتهای صاف تولید می کنند ، که به راحتی منجر به خطاهای خواندن قاب می شود و بنابراین بیان نمی شود.

2. انتخاب نادرست باکتریهای میزبان. باکتریهای میزبان مختلف ژنوتیپهای مختلفی دارند.

برای برخی از بردارهای اصلاح شده خاص ، یا بردارهای مخصوص ، یا بردارهای دارای پروموترهای خاص ، باید باکتری های میزبان مناسب برای بیان انتخاب شوند.


بنابراین ، هنگامی که پروتئین شما بیان نمی شود ، می توانید جایگزین باکتری های میزبان شوید.


3. فراوانی استفاده از کدون کم است. برخی از ژن ها خود حاوی کدون های نادر زیادی هستند ، به خصوص کدون های نادر در 15 پایه پس از کدون شروع ، که تأثیر بسزایی در بیان پروتئین دارند. به نظر می رسد کدونهای بهینه شده تأثیر خوبی بر بیان پروکاریوتی دارند ، اما تأثیر خوبی بر روی سیستمهای بیان یوکاریوتی ندیده اند.

4- پلاسمید ناپایدار یا از بین رفته است. سیستم های pET معمولاً نسبتاً پایدار هستند. اما هنگامی که ناقل با مقاومت به آمپی سیلین را انتخاب می کنید ، ممکن است بتوانید β-galactosidase تولید کنید که آنتی بیوتیک را تخریب کرده و پلاسمید را از دست می دهد.

وضعیت دیگر بیان پروتئین سم نوترکیب است که برای سلولهای میزبان نیز سمی است و باعث از بین رفتن پلاسمید می شود. این وضعیت بیشتر در سیستم های بیان یوکاریوتی دیده می شود.


5- پروتئاز پروتئین را تخریب می کند. این وضعیت اغلب توسط دنباله N- یا C- ترمینال پروتئین نوترکیب خود ایجاد می شود. وقتی ترمینال N پروتئین Arg ، Leu ، Lys ، Phe ، Trp یا Tyr باشد ، این اسیدهای آمینه مستعد تخریب پروتئاز هستند ، که این قاعده N ترمینال است.

هنگامی که ترمینال N ملاقات می کند ، E. coli می تواند این Met را بی سر و صدا سرقت کند ، به ویژه هنگامی که Met توسط یک اسید آمینه با یک زنجیره جانبی کوچک دنبال می شود.

وجود اسیدهای آمینه غیر قطبی در انتهای C نیز می تواند به راحتی منجر به تخریب پروتئین شود. 5 اسید آمینه آخر در ترمینال C قطبی یا شارژ شده هستند و به راحتی تجزیه نمی شوند.


6. سایت شروع ترجمه ثانویه. این مورد زمانی است که توالی شما دقیقاً همان توالی محل اتصال ریبوزوم را داشته باشد.

ریبوزوم این سایت را پیدا می کند و شروع به ترجمه می کند ، باعث می شود پروتئین شما کوتاه شود و در طول الکتروفورز قطعاتی از اندازه مورد انتظار دیده نمی شود.


7. توالی SD. فاصله بین توالی SD و توالی کدون شروع (80٪ AUG و GUG است) نیز تأثیر بسیار مهمی در کارایی بیان پروتئین دارد.

ترکیب توالی SD نیز خود بر کارایی ترجمه تأثیر می گذارد. گاهی اوقات به منظور کاهش تولید اجسام شامل ، توالی SD به طور خاص اصلاح می شود!


8. ساختار ثانویه mRNA. قبل از شبیه سازی ، باید ببینید آیا توالی مکمل سایت اتصال ریبوزوم و / یا سایت شروع ترجمه در دنباله شما وجود دارد یا خیر.

9. خاتمه غیر منتظره. این وضعیت در تقویت توالی PCR دیده می شود. به عنوان مثال ، این TAC را در وسط دنباله به TAA جهش می دهد ، که باعث مهار ترجمه پروتئین شما می شود.

بنابراین ، تعیین توالی باید قبل از بیان انجام شود تا از این وضعیت جلوگیری شود.


10. پایان دهنده رونویسی. وجود پایان دهنده رونویسی می تواند بیان پروتئین را تقویت کند. اما وقتی فقدان باشد ، باعث "خواندن" می شود و بی پایان می خواند.

این در سیستم PET مشکلی ندارد زیرا دارای یک ژن نشانگر انتخابی در جهت مخالف ژن هدف است.

اگر به طور اتفاقی ژن هدف شما با این ژن نشانگر هم جهت باشد ، باید ببینید که آیا بعد از ژن هدف شما خاتمه دهنده رونویسی وجود دارد یا خیر.


11. بی ثباتی mRNA. mRNA ژن هدف اغلب در سلول تجمع می یابد. اما mRNA باکتری های کلی فرم بسیار ناپایدار است.

اگر یک توالی ساختاری پایدار در منطقه 5'-ترجمه نشده و پایان دهنده مستقل 3'-rho از mRNA قرار داده شود ، می توان ثبات mRNA را ارتقا داد.

خصوصاً اگر 5'end ساختار برجستگی مو بدون برجستگی داشته باشد ، می تواند mRNA را در سیتوپلاسم بی جان کند.


12. امکان سنجی روش کشف. گاهی اوقات ، پروتئین واقعاً بیان می شود ، اما میزان بیان آن بسیار کم است ، یا آنقدر به باند متفرقه نزدیک است که به اشتباه فکر می کنید پروتئین بیان نشده است.

در این زمان ، شما نباید دو قانون طلایی آزمایش های بیولوژیکی را فراموش کنید: کنترل و تکرار.



به طور خلاصه ، هر ماده آزمایشی بسیار مهم است. ساخت صحیح ناقلین بیان پروتئین اساس آزمایش بیان پروتئین است.

بنابراین ، باید از صحت ناقلین بیان پروتئین اطمینان حاصل شود. باکتری میزبان مناسب نیز اساس آزمایش بیان پروتئین است.


اگر در روند بیان پروتئین مشکلی دارید ، می توانید از General Biosystems کمک بخواهید. General Biosystems می تواند خدمات بیان و تصفیه پروتئین سفارشی را برای پاسخگویی به بیشتر نیازهای تولید پروتئین شما فراهم کند.