خانه > اخبار > اخبار صنعت

استراتژی های مشترک زیرخطی

زمان بروزرسانی: 2020-08-05

منبع:

بازدید: 94

استراتژی های مشترک زیرخطی

برای مطالعه عملکرد مطلوب یک درج ، نیاز به انتقال آنها از یک بردار به دیگری وجود دارد ، این روش انتقال به عنوان subcloning شناخته می شود . مراحل Subcloning:


  • درج خود را از بردار اصلی آزاد و پاک کنید
  • این درج را به یک بردار مقصد آماده پیوند دهید
  • این واکنش بستن را به سلولهای باکتریایی شایسته تبدیل کنید
  • سلولهای تبدیل شده را برای قرار دادن در صفحه نمایش دهید

استراتژی های مختلف Subcloning

برای انجام هر کاری در زیر ردیف کردن ، برخی دانش پیش نیاز در مورد بردار و درج لازم است.

اطلاعات مربوط به سایتهای RE موجود در مناطق شبیه سازی چندگانه بردار والدین ، سایتهای RE در دسترس است (در صورت هضم درون ریز). همچنین اطلاعاتی درباره عود سایتهای RE در مناطق شبیه سازی چندگانه بردار مقصد و سایتهای RE درج شده است.

بسته به ترکیب متفاوت این سایت ها ، استراتژی subcloning مورد استفاده تصمیم گیری می شود.


✦ سایت های محدودیت مشترک

اگر مناطق شبیه سازی چندگانه پدر و مادر و مقصد حاوی سایت های محدودیت مشترک باشند و هیچ یک از این سایت های محدودیت در داخل شما رخ ندهد ، می توان از یک فرآیند مستقیم زیر طبقه بندی استفاده کرد.

بردارهای اصلی و مقصد هر دو با استفاده از همان دو آنزیم هضم می شوند. به دنبال آن فسفوریلاسیون بردار مقصد انجام می شود. با استفاده از ژل آگارز ، داخل و بردار دفسفریله را جدا کنید. سپس بردار را با استفاده از هر سیستم تصفیه DNA خالص کنید. سرانجام ، این بردارها و درج ها بند می شوند.


انتقال درج ها با سایت های محدود سازگار

  مواردی وجود دارد که سایت های محدودیت در مناطق شبیه سازی چندگانه والدین و مقصد معمول نیستند اما ممکن است سازگار باشند. سایت های محدود سازگار دارای توالی برآمدگی یکسان هستند و می توان آنها را با هم پیوند داد.

پس از بستن ، سایت های بازسازی شده هر دو سایت محدودیت در مناطق شبیه سازی چندگانه پدر و مادر و مقصد را شباهت ندارند. پس از شناسایی آنزیم های لازم برای بستن و محدودیت. این استراتژی شبیه سازی نیز ساده می شود.


انتقال درج ها فقط با یک سایت مشترک


ترکیبی از سایت های محدود کننده معمول منجر به این می شود که فقط یک مسابقه در یک طرف درج شما قرار گیرد. موضوع باید در طرف دیگر درج قرار گیرد. می توان از برش برش برش استفاده کرد.

عملکرد T4 DNA Polymerase می تواند هر مکان محدود کننده ای را کم رنگ کند. ناقل والدین را هضم کرده و آن محل را با T4 DNA پلیمراز صاف کنید. محصولات را روی ژل اجرا کنید ، هضم آنزیم محدودکننده پایان متداول یا سازگار را تصفیه کرده و ادامه دهید.

اکثر بردارها حداقل دارای یک سایت محدود کننده با انتهای بلانت هستند که می توانند انتهای بی پرده تازه ایجاد شده را از قسمت درج قبول کنند.

اگر چنین سایتی ندارید یا سایت از جهت درستی برخوردار نیست ، ممکن است همان استراتژی "cut-blunt-cut" برای مقصد اعمال شود.


روش بلانت پایان

سناریوی نهایی هیچ سایت محدودیت مشترک با بردار اصلی یا مقصد سازگار نیست.

در این سناریو بهترین استراتژی تقویت درج با محل های محدودیت در آغازگرها برای ایجاد سازگاری است. اما این روش مشکلات خاص خود را دارد.

احتمال جهش وجود دارد. همچنین ، هضم محصولات PCR بسیار دشوار است. در این سناریو می توان از یک استراتژی دیگر استفاده کرد. داخل آن را با هر آنزیم برش دهید.

با T4 DNA Polymerase تحت درمان قرار بگیرید تا 5 ′ یا 3 ′ برآمده شود و به بردار مقصد باز شود که با یک برش انتهای بلانت باز شود و یا توسط T4 DNA پلیمراز صاف شود. با استفاده از این روش ممکن است جهت گیری ایزرت حفظ نشود.