خانه > اخبار > اخبار صنعت

مشخصات سیستم بیان E. coli

زمان بروزرسانی: 2020-12-10

منبع:

بازدید: 38

مشخصات سیستم بیان E. coli

اشرشیاکلی اولین باکتری میزبان است که برای بیان پروتئین نوترکیب استفاده می شود. تاکنون Escherichia coli همچنان ابزار اصلی در زمینه بیان پروتئین محسوب می شود. زمان تکثیر E. coli نسبتاً کوتاه است ، بنابراین سیستم بیان E. coli راهی سریع می شود. معمولاً بیان ژن های نوترکیب در E. coli فقط کمتر از 1 هفته طول می کشد.

در همان زمان ، سیستم بیان E. coli همچنین دارای مزیت قیمت کم محیط کشت E. coli است.

E. coli Protein  Expression System

نهاد شمول

در E. coli ، پروتئین های نوترکیب معمولاً در سیتوپلاسم قرار دارند ، همچنین می توانند در پری پلاسم قرار بگیرند و در موارد کمی در خارج سلول ترشح می شوند. بازده بیان پروتئین های واقع در سیتوپلاسم بالاترین است و عملکرد می تواند معمولاً 30٪ از کل زیست توده را تشکیل دهد.

با این حال ، بیان بیش از حد پروتئین نوترکیب ممکن است منجر به تجمع سنگدانه های پروتئین نامحلول شود و بدین ترتیب اجسام انسداد تشکیل شود.


این فقط پروتئین های مشتق شده از یوکاریوت ها نیستند که اجسام انسداد را تشکیل می دهند ، بلکه در چند مورد ، بیان بیش از حد پروتئین های حاصل از پروکاریوت ها مانند E. coli نیز می تواند اجسام انسداد ایجاد کند.

در E. coli ، میزان انتقال و تاشو پروتئین تقریباً 10 برابر بیشتر از سلولهای یوکاریوتی است ، که ممکن است دلیل تشکیل پروتئین های یوکاریوتی بدن درگیر باشد. در بعضی موارد ، بدن های درگیر تا حد زیادی مانع دسترسی به پروتئین فعال محلول می شوند.


نهادهای ورود به سیستم همچنین دارای مزایای خاصی هستند. معمولاً اجسام درگیر توسط پروتئازها به راحتی تخریب نمی شوند ، به راحتی با سانتریفوژ متمرکز می شوند و بندرت توسط پروتئین های دیگر آلوده می شوند. از طریق برخی ابزارهای خاص ، بدن می تواند به پروتئین های محلول فعال باز شود.
E. coli Protein  Expression System

دما و چپرونهای مولکولی باعث کاهش تشکیل اجسام شامل می شوند


پایین آوردن دما تا 15-30 درجه سانتیگراد در طی بیان پروتئین به پروتئین نوترکیب اجازه می دهد تا آنجا که ممکن است پروتئین محلول صحیح تا شده ممکن تشکیل دهد ، در حالی که کمترین تعداد اجسام شامل را دارد.

برخی گمانه زنی ها نشان می دهد که کاهش دما باعث کاهش سرعت رونویسی پروتئین ، ترجمه و تاشو می شود ، بنابراین پروتئین می تواند به درستی تا شود. در عین حال ، دمای پایین همچنین باعث کاهش فعالیت پروتئاز شوک گرمایی می شود.


بعلاوه ، برخی از محققان با بیان همزمان چاپرونها با پروتئینهای نوترکیب در سیتوپلاسم ، حلالیت پروتئین ها را تقویت می کنند. استفاده از چاپرون های مولکولی ممکن است مختص پروتئین باشد ، بنابراین آزمایشات باید برای هر پروتئین نوترکیب هدف به طور جداگانه انجام شود.

برچسب های همجوشی باعث حل شدن پروتئین های نوترکیب می شوند


روش دیگر برای بهبود حلالیت بسیاری از پروتئین های نوترکیب ، ترکیب برچسب همجوشی محلول در انتهای N یا انتهای C پروتئین نوترکیب است.

برچسب های همجوشی که نشان داده شده است برای حل شدن پروتئین های نوترکیب شامل گلوتاتیون S ترانسفراز مانند تیوردوکسین ، پروتئین متصل به مالتوز (MBP) ، پروتئین اصلاح شده مانند یوبی کویتین با مولکول کوچک و برچسب NusA (بستر استفاده از JV) است.


در این میان ، برچسب GST و برچسب MBP مزایای اضافی دارند و می توان از آنها به عنوان برچسب های تصفیه میل استفاده کرد. متأسفانه ، هیچ برچسب واحدی برای همه پروتئینهای نوترکیب قابل استفاده نیست و باید توانایی برچسبهای همجوشی متعدد برای تقویت بیان محلول را ارزیابی کرد.


استراتژی های زیادی برای از بین بردن برچسب همجوشی پروتئین نوترکیب وجود دارد. روش معمول این است که یک محل شکاف پروتئاز بین برچسب همجوشی و پروتئین نوترکیب وارد کنید و سپس برای حذف آن از یک پروتئاز خاص استفاده کنید.

با این حال ، گاهی اوقات ممکن است پروتئین نوترکیب پس از حذف برچسب نامحلول شود ، بنابراین این روش باید به دقت آزمایش شود.


تشکیل پیوند دی سولفید


برای بیان سیتوپلاسمی ، E. coli معمولاً نمی تواند باعث ایجاد صحیح پیوندهای دی سولفید پروتئینهای نوترکیب شود. به دلیل وجود کاتالیز سیستم اکسیدوروکتاز پیوند دی سولفید ، پری پلاسم معمولاً تنها مکانی است که می توان پیوندهای دی سولفید را در E. coli تشکیل داد.

بنابراین ، اگر پروتئین نوترکیب نیاز به ایجاد پیوندهای دی سولفید دارد ، باید از پپتید سیگنال قابل تجزیه (مانند pelB) برای قرار دادن آن در پری پلاسم استفاده شود. با این حال ، یکی از معایب اصلی بیان پری پلاسمایی این است که میزان بیان پروتئین بسیار کاهش می یابد.


تیوردوکسین و گلوتاردوکسین می توانند باعث کاهش واکنش اسید همی پترانیک در سیتوپلاسم شوند و ژن تیوردوکسین ردوکتاز و گروه گلوتاتیون ردوکتاز سیستم D sb را از طریق اصلاح ژنوم E. coli از بین ببرند ، این می تواند محیط مناسب تری برای تشکیل پیوند دی سولفید ایجاد کند در سیتوپلاسم

این سویه های مهندسی ژنتیکی توسط EMI> Novagen تجاری شده اند. اگر لازم باشد پیوندهای دی سولفید بیشتری تشکیل شود ، پروتئین نوترکیب را می توان با تیوردوکسین ذوب کرد و در سویه trxB- / gor E. coli بیان کرد.