خانه > اخبار > اخبار صنعت

مزایای روش های تصفیه پروتئین

زمان بروزرسانی: 2020-12-09

منبع:

بازدید: 35

مزایای روش های تصفیه پروتئین

چه تحقیق پروتئین باشد و چه کاربرد آن ، معمولاً لازم است که پروتئین را در سیستم های مختلف بیولوژیکی (مانند E. coli ، مخمر ، ویروس حشرات ، سیستم بیان پروتئین سلول پستانداران و غیره) بیان کرده و سپس آن را جدا و تصفیه کنید. آزمایشگاه های تحقیقاتی معمولاً نیاز به تصفیه میکروگرم یا میلی گرم پروتئین دارند ، در حالی که صنعت نیاز به تصفیه هزاران گرم یا حتی تن پروتئین دارد.


Mammalian cell protein

بنابراین ، تصفیه پروتئین بسیار مهم است. در طول فرآیند تصفیه ، آلودگی میزبان ، حلالیت نمونه ، یکپارچگی ساختار پروتئین و فعالیت بیولوژیکی باید در نظر گرفته شود. تصفیه پروتئین را می توان تقریباً به سه مرحله تقسیم کرد: ضبط نمونه ، مرحله تصفیه میانی و مرحله تصفیه خوب.

ضبط نمونه: درمان جداسازی ، تمرکز و تثبیت

تصفیه متوسط: برای حذف اسید نوکلئیک و سایر اجزای سلولی ، می توان از روش رسوب سولفات آمونیوم استفاده کرد.

تصفیه خوب: پروتئین مورد نظر را از سایر پروتئین ها با اندازه مشابه و خصوصیات فیزیکی و شیمیایی متمایز می کند. روش های معمول شامل کروماتوگرافی فیلتراسیون ژل ، کروماتوگرافی تبادل یونی و کروماتوگرافی میل ترکیبی است.

دستورالعمل تصفیه پروتئین:


1. اهداف را پاک کنید ، از تصفیه بیش از حد یا تصفیه ناکافی خودداری کنید.
2. مشخصات نمونه و ناخالصی های اصلی را شناسایی کرده و روش تصفیه مناسب را انتخاب کنید.
ترکیبی از فناوری تصفیه را می توان با شناسایی پنجره پایداری پروتئین (مانند مقدار pH ، مقاومت یونی) و داده های پروتئین پایه (مانند اندازه پروتئین ، نقطه ایزوالکتریک pl ، آبگریزی ، حلالیت و غیره) به سرعت تعیین کرد.

3. می تواند به سرعت میزان بازیابی ، فعالیت و ناخالصی های پروتئین را تشخیص دهد.

4- مراحل را به حداقل برسانید تا از دست دادن بیش از حد نمونه و کاهش بیش از حد فعالیت جلوگیری کنید.

5- پروتئاز و سایر ناخالصی هایی که ممکن است به نمونه آسیب برساند را در اسرع وقت بردارید.

6. استفاده از مواد افزودنی را به حداقل برسانید ، در غیر این صورت ممکن است مراحل اضافی برای حذف مواد افزودنی لازم باشد.
Escherichia coli expression system

مزایای استفاده از 6 روش تصفیه پروتئین

با توجه به خصوصیات مختلف نمونه ها و پروتئین ها و ناخالصی های موجود در آن ، استراتژی های مختلف تصفیه پروتئین مورد نیاز است.

در حال حاضر شش روش تصفیه پروتئین وجود دارد: کروماتوگرافی فیلتراسیون ژل ، کروماتوگرافی تبادل یونی ، تصفیه برچسب ، کروماتوگرافی میل ترکیبی ، کروماتوگرافی فعل و انفعال آبگریز ، الکتروفورز و غیره ، و حلالیت پروتئین برای خالص سازی پروتئین.


1 کروماتوگرافی فیلتراسیون ژل

کروماتوگرافی فیلتراسیون ژل یک روش کارآمد جداسازی و خالص سازی پروتئین است که مخلوط پروتئین را بر اساس تفاوت در اندازه مولکول جدا می کند.

وقتی محلول پروتئین از یک ستون کروماتوگرافی فیلتراسیون ژل حاوی ذرات بسته بندی شده عبور می کند ، از آنجا که پروتئین های مختلف دارای اندازه های مولکولی مختلف هستند ، توانایی انتشار آنها در ذرات با اندازه خاص و اندازه منافذ نیز متفاوت است.

پروتئین های بزرگ ابتدا شسته می شوند و وزن مولکولی نیز کوچکتر است. ، دیرتر شستشو ، به منظور دستیابی به هدف از جداسازی پروتئین و تصفیه. به طور کلی ، ستون کروماتوگرافی فیلتراسیون ژل نازک تر و طولانی تر ، اثر تصفیه بهتر است.


این فناوری مزایای بسیاری دارد: نرم است ، نمونه به راحتی دناتور نمی شود ، به سختی با پروتئین تاثیری دارد ، قابلیت تکرار پذیری خوبی دارد ، از حلال های آلی استفاده نمی کند و سرعت بازیابی بالایی دارد.

از این روش می توان برای تصفیه پروتئین ، وزن مولکولی و تعیین دامنه توزیع آن ، جایگزینی بافر ، نمک زدایی و غیره استفاده کرد.


2 کروماتوگرافی تبادل یونی

کروماتوگرافی تبادل یونی یک تکنیک برای جداسازی و تصفیه پروتئین ها بر اساس نوع ، کمیت و توزیع بارهای سطح پروتئین است. تحت شرایط خاص ، پروتئین های شارژ شده با نقطه را می توان با ستون تبادل کاتیونی / آنیونی ترکیب کرد و قدرت اتصال را از خود نشان داد. تفاوت.

اتصال قابل برگشت است ، و به تدریج به ترتیب اتصال ضعیف تا قوی در طول کروماتوگرافی تبادل یونی پاک می شود تا جداسازی و خالص سازی پروتئین تحقق یابد.

این فناوری دارای مزایای وضوح بالا ، ظرفیت تبادل پروتئین بالا ، کاربرد انعطاف پذیر ، اصل جداسازی واضح ، عملکرد ساده و غیره است.

برای کاربردهای آزمایشگاهی و در مقیاس صنعتی مناسب است ، در حالی که دستیابی به کاربردهای در مقیاس صنعتی فیلتراسیون ژل دشوار است.


3 کروماتوگرافی میل ترکیبی

در کروماتوگرافی میل ترکیبی از جذب خاص برگشت پذیر ماکرو مولکولهای بیولوژیکی و لیگاندها برای جداسازی و خالص سازی پروتئین ها استفاده می شود. این روش دارای مزایای خاصیت بالا ، شرایط ملایم ، سرعت سریع ، کارایی بالا و ... است و برای تصفیه پروتئین های هدف از نمونه های پیچیده و نمونه هایی با محتوای ناخالصی بالا مناسب است.

می توان از جذب ویژه پروتئین هدف و لیگاند استفاده کرد و یا می توان از اتصال ویژه بین برچسب و لیگاند برای دستیابی به جداسازی و خالص سازی پروتئین با افزودن برچسب استفاده کرد.


4 تصفیه برچسب

تصفیه برچسب با استفاده از فناوری نوترکیبی ژنتیکی ، چند آمینو اسید اضافی به انتهای آمینو یا کربوکسیل پروتئین به عنوان برچسب اضافه می کند ، که جداسازی و تصفیه را تسهیل می کند. برچسب های معمول شامل GST ، His ، MBP ، Strep-tag II و غیره است.

برچسب GST: گلوتاتیون اس ترانسفراز (GST) را به توالی پروتئین اضافه کنید ، سپس از گلوتاتیون سفاروز 4B برای تصفیه میل استفاده کنید و آنرا با ترومبین یا فاکتور Xa برش دهید. این روش شرایط ملایمی دارد و می تواند آنتی ژنی و عملکرد پروتئین مورد نظر را حفظ کند.

برچسب وی: هیستیدین (His) یکی از برچسب های رایج است ، زیرا هیستیدین بسیار کوچک است و به سختی بر عملکرد ، فعالیت و ساختار پروتئین هدف تأثیر می گذارد. 6-10 هیستیدین به اسید آمینه اضافه کنید.

در شرایط دناتوراسیون ، زیرا می تواند محکم به ستون کلاته Ni2 + متصل شود ، با ایمیدازول پاک می شود تا به جداسازی پروتئین و خالص سازی برسد.


5 کروماتوگرافی متقابل آبگریز

اصل کروماتوگرافی برهم کنش آبگریز این است: تحت قدرت یونی بالا ، پروتئین موجود در سیستم آب نمکی تا حدی از بین می رود و گروه های آبگریز داخلی در معرض آن قرار می گیرند.

این باقیمانده ها می توانند فعل و انفعالات آبگریز برگشت پذیر با گروه های عملکردی آبگریز در محیط داشته باشند. وقتی غلظت یون کاهش می یابد ، گروه آبگریز پروتئین پنهان می شود ، اثر از بین می رود و شستشو کامل می شود.

با توجه به نیروهای مختلف آبگریز بین پروتئینهای مختلف و لیگاندهای آبگریز در محیط ، می توان به جداسازی و خالص سازی پروتئین ها دست یافت. این روش هزینه کمی دارد ، می تواند فعالیت بیولوژیکی پروتئین را حفظ کند و به طور گسترده ای مورد استفاده قرار می گیرد.


6 الکتروفورز

اصل الکتروفورز برای جداسازی و خالص سازی پروتئین ها این است که تحت تأثیر یک میدان الکتریکی ، ذرات کلوئیدی خال خال به سمت الکترود با خصوصیات الکتریکی مخالف حرکت می کنند و هرچه مولکول بزرگتر باشد ، سرعت حرکت کندتر می شود.

از SDS-PAGE می توان برای جداسازی و خالص سازی پروتئین ها استفاده کرد. پروتئین می تواند توسط عوامل رنگ آمیزی تولید شود. مزیت آن این است که کارکرد آسان ، اقتصادی و شهودی است. نقطه ضعف این است که نمی توان از آن در مقیاس بزرگ استفاده کرد.