خانه > اخبار > اخبار صنعت

مزایای بیان و خالص سازی پروتئین برچسب وی

زمان بروزرسانی: 2020-11-06

منبع:

بازدید: 42

مزایای بیان و خالص سازی پروتئین برچسب وی
برچسب وی بر اساس زنجیره جانبی بقایای هیستیدین در سطح پروتئین است. در شرایط خنثی و قلیایی ضعیف ، می تواند با یونهای فلزی بی حرکت (مانند یون های Ni ، یون Zn ، یون Co و غیره) در تعامل باشد و به پروتئین خالص برسد. در حال حاضر یکی از برچسب های رایج تصفیه پروتئین است .

1. His-tag چیست?

برچسب His معمولاً مورد استفاده برای بیان و خالص سازی پروتئین نوترکیب است. پروتئین بیان شده چه محلول باشد و چه بدن درگیر ، می تواند توسط کروماتوگرافی میل ترکیبی یون فلز بی حرکت (IMAC) خالص شود.

کروماتوگرافی میل ترکیبی فلزات ، همچنین به عنوان کروماتوگرافی میل یونی فلزی بدون حرکت (IMAC) شناخته می شود ، نوع جدیدی از فناوری جداسازی است که در 30 سال گذشته توسعه یافته است.

اولین بار توسط Paroth و همکاران ارائه شد. این روش از این اصل استفاده می کند که برخی اسیدهای آمینه روی سطح پروتئین مانند هیستیدین ، تریپتوفان و سیستئین می توانند با یون های فلزی در تعامل باشند و پروتئین را جدا کنند.

این توابع شامل پیوند مختصات ، جذب الکترواستاتیک و پیوند کووالانسی است. در میان آنها ، پیوند مختصات اصلی ترین مورد است. در میان آنها ، برچسب 6-هیستیدین (His-Tag) بیشترین استفاده را دارد.


برچسب تصفیه His-Tag همراه با کروماتوگرافی میل ترکیبی فلز ابزاری قدرتمند برای جداسازی ، بیان و تصفیه پروتئینهای نوترکیب فراهم می کند.

از آنجا که کروماتوگرافی میل ترکیبی فلز دارای ویژگی های لیگاند ساده ، ظرفیت جذب زیاد ، شرایط جداسازی ملایم و قابلیت انعطاف پذیری قوی است ، شرایط بارگیری نمونه را می توان در محدوده وسیعی ، تحت شرایط نمک بالا ، غلظت خاصی از دناتور و مواد شوینده انتخاب کرد. در زیر کاپوت ، پروتئین های دارای برچسب های تصفیه 6His را می توان به طور خاص با مواد پرکننده ترکیبی ترکیب کرد و به تدریج به یکی از موثرترین تکنیک ها برای جداسازی و تصفیه پروتئین ها و سایر محصولات مهندسی زیستی تبدیل شد.


2. تگ وی اولین انتخاب برای تصفیه پروتئین است


(1) His-Tag بسیار کوچک است و هیچ تأثیری بر ساختار پروتئین پس از تبلور پروتئین همجوشی ندارد.

(2) His-Tag در ترمینال N با سازوکار رونویسی و ترجمه باکتری ها که منجر به بیان و خالص سازی پروتئین می شود سازگار است.

(3) استفاده از IMAC (کروماتوگرافی میل میل یون فلزی بی حرکت) برای تصفیه پروتئین همجوشی His-Tag آسان تر است.

(4) His-Tag تقریباً هیچ تأثیری بر خصوصیات پروتئین هدف ندارد و دیمر ایجاد نمی کند.

(5) ایمنی زایی His-Tag نسبتاً کم است و پروتئین خالص شده را می توان به طور مستقیم برای ایمن سازی و تهیه آنتی بادی به حیوانات تزریق کرد.

(6) یک برچسب میل دوگانه با سایر برچسب های میل ایجاد کنید و می تواند برای انواع سیستم های بیان استفاده شود.

3. مشکلات رایج تصفیه پروتئین برچسب وی


(1) پروتئین برچسب وی به محیط متصل نمی شود

  • علت احتمالی: قدرت سونوگرافی نامناسب (خیلی بزرگ ، پروتئین کربن دار ، خیلی کوچک ، پروتئین به طور کامل آزاد نمی شود). راه حل: قدرت اولتراسونیک یا روش های دیگر برای شکستن سلول ها را تغییر دهید.
  • نمونه یا بافر نامناسب است. راه حل: اطمینان حاصل کنید که غلظت ماده شیمیایی ، عامل احیا کننده و ایمیدازول در بافر زیاد نیست.
  • برچسب وی کاملاً در معرض دید قرار نگرفته است. محلول: دناتورنت (4-8 میلی گرم اوره ، 4-6 میلی گرم گوانیدین هیدروکلراید) را به بافر اضافه کنید و سپس با محیط IMAC تصفیه کنید.
  • نشان او گم شده است. راه حل: در صورت لزوم ، تعداد He's را افزایش داده و از بیان صحیح اطمینان حاصل کنید ، ضمن اینکه سرعت بارگذاری را کاهش می دهید تا از زمان جوجه کشی کافی اطمینان حاصل کنید.

(2) پاک کردن پروتئین برچسب وی بر روی محیط سخت است

  • علت احتمالی: شرایط شستشو خیلی خفیف است. محلول: غلظت ایمیدازول شسته شده را افزایش دهید یا PH را کاهش دهید.
  • علت احتمالی: پروتئین روی محیط رسوب می کند. راه حل: بار نمونه را کاهش دهید و شرایط کروماتوگرافی را بهینه کنید.
  • علت احتمالی: اتصال غیر اختصاصی. محلول: 2٪ تریتون X-100 و NaCl را به بافر اضافه کنید.

(3) اوج شستشو ناخالصی های زیادی دارد

دلایل احتمالی: اتصال غیر اختصاصی ، تمیزکاری ناقص ، تخریب و غیره محلول: در فرآیند تصفیه ، برای جلوگیری از تخریب ، مهارکننده های پروتئینی اضافه کنید ، پس از بارگیری کاملاً بشویید و مقدار مشخصی NaCl و ایمیدازول به آن اضافه کنید تا اتصال غیر اختصاصی کاهش یابد.

(4) پس از چندین بار استفاده ، بازده اتصال رسانه و بازده ستون کاهش می یابد

علت احتمالی: مقدار زیادی ناخالصی بر روی محیط رسوب می کند. راه حل: تمیزکاری کامل ، درمان احیا de دی نیکل IDA / IMAC.



فقط با انتخاب یک بیان پروتئین مناسب و روش تصفیه می توانیم پروتئین نوترکیب با خلوص بالا بدست آوریم. تعداد زیادی از پروتئین های نوترکیب خالص را می توان در مجموعه ای از زمینه های زیست پزشکی مانند غربالگری دارو ، تحقیقات زیست شناسی ساختاری ، تحقیقات زیست شناسی سلولی و پروتئومیکس استفاده کرد.

General Biosystems با موفقیت یک پلت فرم سیستم بیان پروتئین یوکاریوتی سلول پروکاریوتی و مخمر E. coli کامل ساخته و می تواند مجموعه کاملی از خدمات از طریق ساخت پلاسمید بیان پروتئین ، اکتشاف شرایط بیان پروتئین و تصفیه بیان پروتئین را با توجه به نیاز مشتری ارائه دهد.