خانه > اخبار > اخبار شرکت

8 شرط برای بیان پروتئین توسط میکروارگانیسم ها

زمان بروزرسانی: 2020-09-27

منبع:

بازدید: 59

8 شرط برای بیان پروتئین توسط میکروارگانیسم ها

بیان پروتئین در میکروارگانیسم ها یک فن آوری اصلی در بیوتکنولوژی است. بیان پروتئین در یک میزبان مشابه منبع پروتئین هدف نسبتاً آسان است.

با این حال ، در بیشتر اوقات ، ما نیاز به بیان پروتئین در یک میزبان متفاوت از منبع پروتئین داریم ، مانند بیان پروتئین های یوکاریوتی در سلول های پروکاریوتی ، که معمولاً چالش برانگیز است.


در اینجا ، General Biosystems ابزارهای مختلفی را برای دستیابی به بیان پروتئین در سیستم ها با شما به اشتراک می گذارد.

1. بهینه سازی کدون
بهینه سازی کدون معرفی کدونی است که سیستم میزبان تمایل بیشتری برای خواندن در برداری دارد که ما ساخته ایم ، تا بتوان آن را به آسانی به اسیدهای آمینه ترجمه کرد ، که این باعث افزایش سرعت ترجمه و افزایش کارایی بیان پروتئین می شود.

2. برچسب های تصفیه

وقتی پروتئین ها را در میکروارگانیسم ها بیان می کنیم ، معمولاً پروتئین ها را تصفیه می کنیم. البته ، اگر فقط از عصاره سلول کامل یا عصاره لیز شده استفاده می کنید ، نیازی نیست که تصفیه پروتئین را در نظر بگیرید.

برای دستیابی به تصفیه پروتئین ، باید برچسب های تصفیه را به پروتئین اضافه کنیم. در حال حاضر ، بسیاری از برچسب های تصفیه به طور سیستماتیک مورد مطالعه و استفاده قرار گرفته اند. برچسب های تصفیه معمولاً مورد استفاده شامل برچسب His ، برچسب Strep-II ، GST ، Flat-Tag و غیره است.


3. چاپرونهای مولکولی و آنزیمهای تاشو
برای به دست آوردن یک پروتئین مفید ، اطمینان از جمع شدن صحیح پروتئین بسیار مهم است. برای کمک به پروتئین در برابر خوردگی صحیح و جلوگیری از تشکیل اجسام احتراق نامحلول ، ما به بردارهای کمکی که بیانگر چاپونها و آنزیمهای تاشو هستند ، نیاز داریم.

4. محل بیان پروتئین

قبل از آزمایش ، باید بررسی کنیم که پروتئین در کجا بیان می شود ، آیا در سیتوپلاسم ، ماده بین سلولی یا خارج سلول ترشح می شود.

اگر پروتئینی حاوی پیوندهای دی سولفید است ، بهتر است آن را در محیط اکسیداتیو ماده بین سلولی بیان کنیم.

محیط اکسید کننده می تواند به پروتئین ها کمک کند تا پیوندهای دی سولفید صحیح ایجاد کنند تا ساختار صحیحی بدست آید.

اگر می خواهید پروتئین در یک مکان خاص در سلول بیان شود یا در خارج از سلول ترشح شود ، باید یک پپتید سیگنال به انتهای N پروتئین اضافه کنید. با کمک پپتیدهای سیگنال می توان پروتئین ها را به مکان های خاصی منتقل کرد.


5. مسیر بیان پروتئین

ترشح و بیان پروتئین مزایای زیادی دارد. از یک طرف ، ترشح و بیان پروتئین ها می تواند سمیت و بار متابولیکی موجود در باکتری میزبان را کاهش داده و سازگاری باکتری ها را افزایش دهد. از طرف دیگر ، محتوای پروتئین باکتری میزبان در فضای پلاسمایی و محیط خارج سلول بسیار کم است ، که منجر به تصفیه پروتئین هدف می شود.

مسیرهای مختلف بیان تأثیر زیادی بر کارایی تاشو پروتئین ها دارند.


6. فشار بیان

سویه های مختلف اشریشیا کلی تفاوت زیادی در شرایط کشت و قابلیت بیان ژن خارجی دارند. بنابراین ، انتخاب باکتریهای مختلف میزبان نقشی حیاتی در تجمع محصولات بیان و جداسازی و تصفیه پایین دست ایفا می کند.

استفاده از سویه های جهش یافته معیوب در بیان پروتئاز می تواند باعث افزایش ترشح و بیان پروتئین های نوترکیب شود.

برخی از سویه های معیوب (مانند جهش های ژنی که عناصر غشای خارجی را سنتز می کنند) می توانند پروتئین های فعال محلول با ساختار مکانی صحیح و پیوندهای دی سولفید تولید کنند و می تواند از اثر مانع دیواره سلولی در انتقال غشایی پروتئین های خارجی جلوگیری کرده و ترشح پروتئین های نوترکیب به محیط کشت.


7. عواملی مانند محیط کشت ، دما ، شرایط القایی و ...

ترکیب متوسط ، روش کشت ، شرایط کشت و تجمع متابولیت های بازدارنده در طی فرآیند کشت ، بر بیان و ترشح پروتئین نوترکیب در باکتری های مهندسی تأثیر می گذارد. در این میان ، ترکیب مواد مغذی محیط ، pH و دما از فاکتورهای مهمی هستند که بر رشد و بیان پروتئین های خارجی باکتریهای مهندسی تأثیر می گذارند و می توانند بر فعالیت ، ترشح و بیان پروتئاز تأثیر بگذارند.

افزودن گلیسین به محیط کشت می تواند باعث ترشح پروتئین از فضای پری پلاسمایی به خارج سلول بدون ایجاد اتولیز باکتری شود و باعث لیز باکتریایی قابل توجهی نمی شود. افزودن صمغ قند و TritonX-100 به محیط می تواند از تشکیل اجسام انسداد در حفره محیطی جلوگیری کرده و کارایی بیان خارج سلول را بهبود بخشد.

تغییر فشار اسمزی محیط ، القای شوک حرارتی کوتاه مدت و کاهش دما در هنگام القای بیان محلول پروتئین نوترکیب را در E. coli افزایش می دهد.

علاوه بر این ، برای سویه هایی که به القای IPTG نیاز دارند ، زمان القای ، دما و زمان کشت باید بهینه شود.


8. زمان کشت سلول

زمان مناسب کشت سلول عامل مهمی است که یکپارچگی سلول و سطح بیان پروتئین را تعیین می کند. مدت زمان طولانی کشت سلول باعث لیز سلول ، از بین رفتن پروتئین هدف و آزادسازی پروتئازهای سمی خواهد شد.

نتیجه مستقیم زمان کشت سلول بسیار کوتاه این است که غلظت سلول کافی نیست و عملکرد پروتئین هدف بسیار کم است. بنابراین ، زمان کشت سویه های نوترکیب باید بهینه شود.